l
l Vzorec elektroforézy kolagenu po vysolení.
Enzymatická extrakce znamená, že po extrakci rozpustného kolagenu a kolagenu rozpustného v kyselině je nutné některé proteázy, jako je kolagenáza, pepsin, papain a chymotrypsin, hydrolyzovat, aby se získaly různé enzymaticky rozpustné kolageny. Používané proteázy se dělí především na 3 typy: živočišné proteázy (jako je trypsin, pepsin), rostlinné proteázy (jako je papain, bromelain) a mikrobiální proteázy (jako jsou alkalické proteázy, neutrální proteázy). Při výzkumu enzymatické hydrolýzy kolagenu je nejvíce využívána alkalická proteáza.
Kolagen je degradován omezeným způsobem, to znamená, že je odštěpen koncový peptid. Protože kovalentní vazby mezi kolagenovými peptidovými řetězci jsou tvořeny interakcí lysinu nebo hydroxylysinu v molekulárním koncovém peptidu, je koncový peptid štěpen. Hlavní část obsahující strukturu trojité šroubovice může být rozpuštěna ve zředěných organických kyselinách a extrahována. Enzymové ošetření může hydrolyzovat koncový peptid kolagenového fibrinu, zlepšit výtěžnost kolagenu; a nezničí strukturu trojité šroubovice kolagenu a zachová její vlastnosti. Existuje mnoho faktorů, které ovlivňují extrakci enzymu, jako je koncentrace enzymu, poměr enzymu k substrátu, doba enzymatické hydrolýzy, teplota enzymatické hydrolýzy, hodnota pH a poměr materiálu ke kapalině. Ve skutečném provozu je většina kolagenu extrahována metodou enzymové sloučeniny a další je extrahována pepsinem a organickou kyselinou je většinou kyselina octová.
l Elektroferogram kolagenu extrahovaného pepsinem
Proces enzymatické hydrolýzy kolagenu se dělí především na metodu jednoenzymové hydrolýzy a metodu multienzymové hydrolýzy. Metoda multienzymatické hydrolýzy se dále dělí na metodu smíšené enzymatické hydrolýzy (jako je hovězí trypsin, pronáza, smíšená bacil proteáza) a postupnou metodu enzymatické hydrolýzy. Obvykle by měl být vyvinut výběr konkrétního experimentálního postupu a podmínek pro enzymatickou extrakci kožního kolagenu. K získání kolagenových polypeptidů s menší molekulovou hmotností se obecně používá multienzymová hydrolýza. Hlavními faktory ovlivňujícími účinek enzymolýzy jsou typ enzymu, množství přidaného enzymu, teplota enzymolýzy, doba enzymolýzy, hodnota pH a poměr materiálu k vodě. Použitím enzymatické extrakce kolagenu v agregátu lze nejen efektivně zkrátit dobu extrakce, ale také získat kolagen s dobrou biologickou aktivitou a znečištění životního prostředí je také malé. Kolagen není snadno hydrolyzován běžnou proteázou, ale může být rozbit zvířecí kolagenázou a rozbité fragmenty mohou být hydrolyzovány běžnou proteázou po automatické denaturaci. Vhodné podmínky pro hydrolýzu kolagenu pepsinem jsou pH 1.{7}},70 a teplota 37 stupňů .
Někteří lidé používají prasečí kosti jako suroviny a využívají enzymatickou hydrolýzu proteázy k nahrazení tradičního procesu výroby lepidla a provádějí experimentální výzkum enzymatické hydrolýzy kolagenu a procesu výroby enzymatického lepidla. Výsledky ukázaly, že pepsin měl nejvyšší míru extrakce kolagenu (46,14 procenta), následovaný trypsinem (43,42 procenta), neutrální proteázou (30,14 procenta) a alkalickou proteázou (21,15 procenta). Hlavní ovlivňující faktory v reakci enzymatické hydrolýzy pepsinu byly optimalizovány jednofaktorovými a ortogonálními experimenty. Výsledky testu ukazují, že optimální podmínky pro extrakci pepsinu jsou, že koncentrace pepsinu je 1 procento, enzymatická hydrolýza se provádí při pH 2,0 po dobu 48 hodin a poté se vysolí v roztoku NaCl o koncentraci 10 procent (w/v ) po dobu 24 hodin. Konečná míra obnovy kolagenu byla 64,77 procenta a rychlost extrakce kolagenu byla 49,75 procenta. Někteří lidé také používali pepsin k extrakci kolagenu z vepřové kůže a hydrolyzovali čtyři různé dávky pepsinu (1 procento, 2 procenta, 2,5 procenta, 3 procenta) odběr vzorků a testování, k simulaci procesu extrakce pepsinu byla použita rovnice HILL prvního řádu. kolagen z prasečí kůže a proces rozkladu rychlosti hydrolýzy pepsinu a nakonec byla získána rychlost extrakce 2% dávky pepsinu a doba hydrolýzy 6-7h. maximum. Někteří lidé používají čerstvou prasečí kůži jako surovinu, hydrolyzují trypsinem za podmínek 50-52 stupně, dávka enzymu je 5000:1 ~ 10000:1, hodnota pH je 9, reakce je 2-3 h, surovina: voda je enzymatická hydrolýza za podmínek 1:2. Výsledky ukázaly, že míra extrakce celkového proteinu byla větší nebo rovna 80 procentům.
l Rychlost obnovy kolagenu v pokožce olihně pepsinem při různé teplotě.
Při použití enzymatické metody k extrakci kolagenu musí být podmínky extrakce přísně kontrolovány:
Za prvé, doba působení enzymu musí být vhodná. Pokud je doba příliš krátká, kolagen se do extraktu plně neuvolní, což ovlivní rychlost extrakce; pokud je doba působení enzymu příliš dlouhá, dojde k nadměrné hydrolýze kolagenu, což má za následek příliš mnoho hořkého oligopeptidu s malou molekulou, což nejen zvýší účinnost separace a čištění. Obtížnost také ovlivňuje funkční vlastnosti a biologickou aktivitu kolagenu.
Za druhé by měla být vhodná teplota enzymatické hydrolýzy. Pokud je teplota příliš nízká, účinek enzymu není zřejmý; pokud je teplota příliš vysoká, způsobí inaktivaci enzymu a denaturaci kolagenu. Podle zpráv, když je pH média o něco nižší než neutrální, je teplota denaturace kolagenu 40-41 stupňů, když je pH média kyselé, je teplota denaturace kolagenu 38-39 stupňů a teplota denaturace kolagenu z rybí kůže je o 7-12 stupeň nižší než teplota denaturace kolagenu z vepřové kůže. Pokud tedy má mít extrahovaný kolagen dobrou biologickou aktivitu, měla by být teplota extrakce nižší než teplota denaturace během procesu extrakce.
Za třetí je třeba vybrat vhodný enzym. Obecně platí, že při extrakci kolagenu z tkáně suchozemských savců je rozumné použít pepsin k extrakci při jeho optimální teplotě, ale u vodních živočichů, jako jsou ryby, je teplota denaturace kolagenu nižší než u suchozemských savců. Proto mnoho proteáz není vhodných a některé funkční vlastnosti a biologické aktivity kolagenu mohou být zničeny, pokud jsou extrahovány při optimální teplotě pro tyto enzymy. Výzkum extrakce kolagenu a jeho polypeptidů enzymatickými metodami je převážně ze zvířecích kůží a jejich vedlejších produktů a existuje jen málo zpráv o použití enzymatických metod k extrakci kolagenu a jeho polypeptidů ze zvířecích kostí.
